CRISPR / Cas9技术
一个或两个控制良好、计划良好的育种步骤可以大大提高利用基因组编辑技术进行基因修改产生的表型数据的可重复性和稳健性。
在过去的18个月里,随着RGEN (rna引导的内切酶)技术的发现和引入许多实验室,哺乳动物遗传学的世界已经被点燃,有时更广为人知的是CRISPR/Cas9 [1].
这项技术带来的希望是,任何生物体的基因组都可以轻松有效地改变。例如,在啮齿类动物中,这可以通过简单地向单细胞受精胚胎注射原核来源的蛋白质(如Cas9)和一个或多个“引导”rna来指导单个或多个基因的精确改变来完成[2].
然而,在现实中,事情并没有那么简单。关于基因组改变在基因组的其他地方(特别是在细胞培养中)发生的脱靶效应和创始人动物的镶嵌现象,已经在许多论坛上得到了很好的讨论[4].转基因技术领域正在研究改良蛋白、改变RNA设计和不同的注射策略,以提高这些技术的准确性和效率。然而,到目前为止,没有任何改进能够消除F0代的马赛克创造。
这是一个快速发展的领域,许多方面将在会议、邮件列表和合作者之间广泛讨论。然而,一场讨论在许多转基因科学家中达成了共识。最好的做法是不使用F0动物进行表型和实验。对单个基因进行纯合子改造的F0小鼠的产生最初点燃了人们的希望,即只需要很少或不需要繁殖就可以产生一组实验动物[5].这将减少动物数量和成本。然而,良好的科学实践的核心必须是结果的稳健性和可重复性。F0小鼠表型不恰当的主要原因是F0动物中嵌合现象的频繁发生。
当RGEN改变基因组的作用延迟到单细胞胚胎之后,就会发生遗传镶嵌现象。在胚胎中,核酸酶诱导的突变可能比合子分裂发生得慢。因此,可能会出现这样一种情况,即基因修饰直到胚胎发育的2-、4-、8-甚至更晚的阶段才实现(图1)。这可能会导致产生一种动物,其中含有混合的细胞,其中一些有修饰,一些没有。此外,使用CRISPR/Cas9技术可以导致同一动物不同胚胎细胞中同一基因位点的不同基因改变。这可能导致嵌合动物的不同细胞携带超过2种不同的突变等位基因类型的目标位点(图2)。的确,由于其生殖细胞包含不同的遗传改变群体,单个F0动物有可能传播多个(5+)不同的等位基因。相反,所期望的基因修饰可能不会传递给F1群体。
![图1:注射CRISPR/Cas9的F0小鼠可能是胚胎发育早期或晚期发生突变的结果。](http://www.jngcut.com/sites/default/files/styles/max_1300x1300/public/2022-01/CRISPR%20Cas9%20figure%201.jpg?itok=zxLr3AtD)
显然,来自这些动物的表型测试的数据既不能重复(因为镶嵌程度难以评估或控制),更重要的是,也不能用于科学解释。
还有其他一些因素使得使用F0动物进行实验存在问题,包括作为F0的养母的品系可能产生的母性影响。3.]和任何培养和微注射的影响。这两个因素都难以控制,并且可能增加影响科学结果完整性的可变性。
![图2:单细胞胚胎注射CRISPR/Cas9后产生的F0小鼠,常出现多等位基因嵌合。这可能导致产生携带3个或3个以上等位基因类型的F1群体,包括那些在耳活检中检测到的标记。](http://www.jngcut.com/sites/default/files/styles/max_1300x1300/public/2022-01/CRISPR%20Cas9%20figure%202.jpg?itok=fex8dSnr)
参考文献
- 许PDet al。(2014)基因工程CRISPR-Cas9的开发与应用。细胞157(6): 1262 - 78。doi: 10.1016 / j.cell.2014.05.010
- Sander JD和jung JK(2014)用于编辑、调节和靶向基因组的CRISPR-Cas系统。生物科技Nat》32(4): 347 - 55。doi: 10.1038 / nbt.2842
- SenthamaraiKannan Pet al。(2011)用一种新的胚胎移植系统在小鼠胎盘中鉴定母系调控的胎儿基因网络。杂志基因组学43(7): 317 - 24。doi: 10.1152 / physiolgenomics.00078.2010
- 曹西南et al。(2014) CRISPR/ cas衍生的rna引导的内切酶和尼克酶脱靶效应分析。基因组Res24(1): 132 - 141。doi: 10.1101 / gr.162339.113
- 王Het al。(2013)利用CRISPR/ cas介导的基因组工程一步生成多基因突变小鼠细胞153(4): 910 - 8。doi: 10.1101 / gr.162339.113
基因改造小鼠的产生和繁殖管理技术的信息,以及改善福利的策略。
![一种嵌合小鼠,可从其有斑纹或斑点的两种颜色的皮毛上识别,在这种情况下为白色和黑色。](http://www.jngcut.com/sites/default/files/styles/image_16_9/public/2021-10/Chimeric%20mouse.jpg?itok=51CpZ19M)