本方案旨在建立环境DNA和RNA (eDNA和eRNA)，结合先进的DNA测序技术(元条形码)，作为评估水生设施中病原体存在的新工具。这项技术有可能降低动物的死亡率和发病率。在使用水生动物健康监测的任何部门寻找合作者，以评估和验证这种eDNA元条形码编码技术与当前实践的对比。也欢迎能够开发和验证包含可搜索的病原体DNA序列的软件的合作伙伴的投入。
水生动物模型(头足类动物、鱼类和两栖动物)被用于各种生物医学环境中，为确定这些动物的饲养、住房、福利和健康状况的准则作出了大量努力(Felasa)等, 2015)。改善动物健康和福利可以提高动物实验的质量、一致性和可靠性，从而更好地解释实验结果。
在水生设施中，病原体的存在通常被用作衡量动物健康的标准。有针对特定物种的病原体小组和鉴定病原体的协议，可用于评估某些物种的健康状况，例如斑马鱼(Collymore)et al .,2016年),非洲爪蟾蜍(Alworthet al .,2007)，以及头足类动物(Fiorito等, 2015)。这些方法通常使用过滤前和过滤后的哨兵鱼、濒死的鱼和有症状的动物群体，并需要从动物身上提取样本(例如，组织和器官的尸检和组织病理学)。使用的哨兵数量根据设施的规模而有所不同，但最近的证据表明，每3到6个月至少要筛查6只哨兵(Mochoet al .,2017)。
最近，实时PCR、常规PCR和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)已被用于识别动物环境污泥样本中的水生病原体(Mocho 2016)。这些方法需要在检测到病原体之前达到一个污染阈值，因此它们是用于监测菌落健康的常规组织病理学哨点筛查的补充工具(Collymoreet al .,2016;锆2009;Mochoet al .,2017)。
引用:
- Alworth LC, Harvey SB(2007)。两栖动物研究IACUC议题。ILAR杂志48(3): 278 - 289。doi: 10.1093 / ilar.48.3.278。
- 科利莫尔C，克里姆·MJ，列吉C(2016)。斑马鱼研究设施健康监测和报告的建议。斑马鱼13增补1:S138-48。doi: 10.1089 / zeb.2015.1210。
- FELASA工作组。可以在:http://www.felasa.eu/working-groups/working-groups-present/zebrafish-housing-husbandry-and-health-monitoring-recommendations/。
- Fiorito G, Affuso A, Basil J，等．(2015)。研究中头足类动物的护理和福利指南——基于CephRes、FELASA和Boyd集团倡议的共识。实验室动物49(2): 1 - 90。doi: 10.1177 / 0023677215580006。
- Mocho JP, Martin DJ, Millington ME，等．(2017)。斑马鱼系统中嗜水气单胞菌、分枝杆菌和绒毛毛细菌的环境筛选。J Vis实验(130): 55306。doi: 10.3791/55306。
- Mocho JP(2016)。三维屏幕:斑马鱼健康监测的综合方法。斑马鱼13补充1:S132-7。doi: 10.1089 / zeb.2015.1200。
- ZIRC，斑马鱼国际资源中心(2009)。哨兵鱼项目。可以在:https://zebrafish.org/documents/protocols/pdf/health_monitoring/sentinel_fish_program．(2018年3月7日访问)。
那不勒斯费德里科二世大学的研究人员开发了一种非侵入性、经济高效的方法，用于检测和识别水生设施中的潜在病原体(病毒、细菌、原生动物、后生动物、寄生虫)。在常规设施监测过程中，使用无菌移液管从每个机架上的所有预过滤槽和三个后过滤槽中(在循环系统中)收集的水样(几毫升)中提取eDNA。eDNA通过PCR扩增，使用的引物可以是针对目标物种的特异性引物，也可以是用于多分类单元分析的通用引物，然后进行测序(Thomsen等, 2015)。利用生物信息学工具将获得的序列与GenBank国际参考数据库进行比较。这个过程被称为元条形码，可以从环境样本中提取的总DNA中快速识别DNA条形码(特定于一个物种的短DNA片段)。在检测到环境中的微生物和潜在病原体对动物的影响之间仍然存在差距，但增加使用这项技术将使人们更多地了解微生物的流行和动物疾病之间的联系。
水生生物(如头足类动物、鱼类和两栖动物)对各种线索(处理、振动、化学物质等)都很敏感，因此该解决方案可用于改进日常健康监测，通过:
- 确保每两个月对水生生物的微生物状况进行一次无创评估。
- 识别机会性感染和新出现的病原体。
- 标准化多物种水生设施的健康监测方案和报告格式，特别是那些含有作为研究模式生物出现的物种的设施。
所有上述行动有助于更好地识别本地和进口动物中的病原体，支持检疫和生物安全措施，防止潜在病原体传播给健康动物，从而提高动物福利。
eDNA元条形码编码可与含有病原体DNA/RNA序列的软件相结合。这个可搜索的数据库将使用户能够根据设施中保存的动物种类过滤病原体条形码序列，从而方便地识别潜在的病原体，减少病原体识别所需的时间。
eDNA元条形码还可以应用于陆地动物的垃圾和粪便，用于分析许多栖息地(水或土壤)，食物来源，并识别新的动物有机体(Brunoet al。, 2015)。
图1。eDNA元条形码的工作流程
引用:
- Bruno, F, Marinella M, Santamaria M(2015)。电子dna元条形码:从NGS原始数据到分类学分析。方法杂志1269: 257 - 78。doi: 10.1007 / 978 - 1 - 4939 - 2291 - 8 - _16。
- Thomsen PF, Willerslev E(2015)。环境DNA -一种监测过去和现在生物多样性的新兴保护工具。生物保护183: 4-18。doi: 10.1016 / j.biocon.2014.11.019。
寻求使用水生动物健康监测的任何部门的合作伙伴来验证这一技术。在eDNA元条形码技术验证后，合作者可以使用该设备常规筛选他们的水生生物的微生物状态，并免费访问相关软件。
潜在的合作伙伴应该熟悉目前的方法(如PCR和微生物MALDI-TOF MS)，并愿意与那不勒斯大学Federico II的研究人员合作，根据他们目前的实践评估和验证这种eDNA元条形码编码技术。合作者将被要求将在他们的设施中收集的水样或扩增和测序的DNA/ RNA片段发送到软件中，以便识别病原体种类。能够提供样本和使用设施的多物种水生设施网络对验证研究也很有价值。
也欢迎能够开发和验证包含可搜索的病原体DNA序列的软件的合作伙伴提供投入。
在进口/出口动物时，病原体的存在尤其重要，因为它可以防止携带亚临床感染的动物的运输，这种感染在运输引起的压力下可能成为致命的。新利体育网页版该技术还可以通过避免患病动物的移动或提高检疫和生物安全措施，防止感染扩散到新设施。这种改进有可能导致所需哨兵数量的减少，因为增加对水中病原体存在的监测和反应会降低蜂群的死亡率和发病率。在该技术开发商的多物种水生设施中，该技术减少了约50%所需的哨兵数量。例如，在他们的斑马鱼设施中，这种技术的应用使哨兵的数量从12只减少到6只。如果在全球的水产设施中扩大规模，这将意味着动物使用的大幅减少。例如，仅在英国就有大约100个水生设施，如果它们每个都使用至少12只哨兵，就有可能在全英国每次健康评估筛查所需的哨兵动物数量减少600只。
此外，通过增加这种技术的使用，有望建立微生物流行率和动物疾病之间的联系，这有可能减少(并有希望取代)哨兵在未来了解蜂群健康状况的需要。
