目前，破伤风疫苗生产依赖于动物模型来评估破伤风类毒素的残留毒性。作为这些模型的替代方案，谢菲尔德大学的研究人员设计了小鼠永生化神经元，携带稳定的VAMP报告分子，克服了以前限制基于细胞的分析开发的挑战。这种基于细胞的定量神经毒素测定方法适用于破伤风和肉毒杆菌产品的开发，正在寻求合作伙伴来帮助验证使用类毒素样本的测定方法。这种方法有可能减少每年用于生产破伤风和肉毒杆菌疫苗的数千只动物。
破伤风神经毒素是一种大的多亚基蛋白，可以毒害脊髓神经元，并通过三步阻断神经传递(Rossetto et。2013)。破伤风神经毒素的重链包括一个用于神经元神经节苷附着的结合域(步骤1)和一个介导破伤风蛋白酶渗透到细胞质(步骤2)的易位域，用于神经元蛋白VAMP(囊泡相关膜蛋白;步骤3)，从而导致神经传递的阻断(Rossetto et。2013)。破伤风类毒素(即破伤风神经毒素灭活制剂)用于生产破伤风疫苗。为了排除残留毒性的风险，每一批破伤风类毒素都经过严格的安全评估，由在活的有机体内动物实验(通常是小鼠和豚鼠)。这种方法引起了广泛的生理变化，但没有检测到破伤风毒性的主要原因-神经元中VAMP分子的切割。这些研究也有重要的福利问题，并在英国许可制度下具有最高的福利严重程度。
几十年来，人们一直强烈希望用基于细胞的测定法取代这些缓慢、昂贵、不道德的动物测定法，从而能够对破伤风行动的所有关键步骤进行敏感的评估。迄今为止，有两个主要问题阻碍了用于检测破伤风残余活性的替代细胞测定法的发展:
- 大多数细胞系不产生破伤风结合所需的神经节苷，因此缺乏用于测定所需的敏感性。原始神经元或胚胎细胞来源的神经元的使用带来了自己的挑战，因为它们必须从组织中新鲜提取，或者需要复杂的程序和几周/几个月才能完全分化。
- VAMP蛋白的缺失或破伤风裂解的VAMP底物的快速降解，排除了神经毒素活性的检测。
需要一种能够在含有大量灭活类毒素分子的混合物中检测低浓度活性破伤风神经毒素的合适方法。
参考
- 罗赛托O，斯克罗泽托M, Megighain A, et。(2013)。破伤风毒素。Toxicon66: 59 - 63。doi: 10.1016 / j.toxicon.2012.12.027。
谢菲尔德大学(University of Sheffield)的研究人员设计了一种vamp报告细胞，将其纳入一种不朽的神经元细胞系中，克服了目前基于细胞的检测的问题，并将加速疫苗的生产和测试。在类毒素应用后24小时内，使用具有最高可能敏感性的酶报告剂可以检测到破伤风裂解的稳定VAMP。该方法基于破伤风的三个特征来检测活跃的破伤风神经毒素分子:特异性受体结合、破伤风蛋白酶易位及其蛋白水解活性。通过考虑所有相关的功能特征，该测定完全区分有毒和解毒分子，与其他相比在体外仅依赖于一种或两种毒素功能的分析(例如内肽酶分析)(Fernández-Salas等, 2012)。该新方法可确保破伤风类毒素生产过程中的批次与批次一致性。
基于细胞的VAMP报告实验也可用于肉毒杆菌产品的生产，无论是用于疫苗开发还是用于生物医学。研究人员使用这种基于细胞的检测方法专门验证了B型和D型肉毒毒素的活性。这种新型的用户友好型克隆细胞系可以在两天内分化，可以作为一种通用的“一刀切”方法用于评估破伤风和所有肉毒杆菌神经毒素，因为这种细胞系将同时具有VAMP和SNAP25神经毒素靶点。
该检测方法有可能为全世界破伤风产品的检测提供基础。破伤风疫苗被列入世卫组织全球基本药物清单，因此这种基于细胞的检测方法的潜在市场规模是巨大的。2012年，世卫组织启动了全球疫苗行动计划，旨在到2020年实现全球破伤风免疫覆盖。葛兰素史克(GlaxoSmithKline)、赛诺菲巴斯德(Sanofi Pasteur)和Mass Biologics等主要疫苗生产商正在投入资源，向发展中国家提供更便宜和更多的普通疫苗库存。
参考
- Fernández-Salas E，王军，莫丽娜，等．(2012)。肉毒杆菌神经毒素血清型一种以细胞为基础的特异性效价测定法，以取代小鼠生物测定法。《公共科学图书馆•综合》7 (11): e49516。doi: 10.1371 / journal.pone.0049516。
正在寻求合作伙伴帮助进一步开发、验证和商业化这种用于破伤风类毒素检测的基于细胞的vamp报告方法。该概念已通过多克隆抗体验证，因此，理想情况下，合作伙伴将协助合并高度特异性的单克隆抗体、适体或识别VAMP多肽破伤风切割端的词根，使检测更加标准化。合作伙伴将协助选择最敏感的克隆细胞系使用真正的类毒素样本。该检测方法也可用于肉毒毒素神经毒素活性的检测，因此也在寻找具有肉毒毒素产品开发专业知识的合作伙伴。
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对科学文献的回顾表明，该项目是新颖的，谢菲尔德大学正在考虑知识产权保护。
全球每年使用数万只啮齿动物生产破伤风疫苗，用于(i)生产破伤风神经毒素，(ii)其化学灭活，(iii)测试残余破伤风神经毒素活性和(iv)测试类毒素的免疫原性。前三个阶段需要分析与神经肌肉麻痹相关的致命影响，这通常被监管机构指定为最高严重程度的限制。每批生产的破伤风疫苗含有10万人剂量。假设全世界每年进行1亿次免疫接种，该行业需要验证1000批破伤风疫苗。如果使用保守估计，在单个疫苗批次验证中使用30只动物，则可以假设工业界每年使用3万只动物进行试验。由于兽医领域的免疫接种数量大致相等，每年至少有6万只豚鼠和小鼠被用于破伤风疫苗的生产。此外，对于进一步增加动物使用的所有联合疫苗，需要在豚鼠中评估“破伤风成分的特异性毒性”。这种基于细胞的神经毒素试验的开发和应用有可能取代许多这些动物试验。
