InMutaGene

背景

基因治疗(GT)正在成为一种医学现实，在一些罕见疾病的基因治疗试验中证明了临床疗效。目前，全球已经启动或批准了超过1800 GT临床试验，虽然大多数是1 /ll期，但每年都有越来越多的产品进入ll期和ll期试验(Ginnet al .,2013)。基于这一进展和Glybera(欧洲首个获得许可的GT产品)的成功，进一步的GT计划正在一些遗传疾病、恶性肿瘤和神经退行性疾病中进行。

人们正在开发各种各样的GT产品来取代或破坏现有的基因。通常治疗性DNA序列是通过载体系统传递的。一些载体永久地整合到基因组中以提供体外或在活的有机体内基因的添加/校正和代表一个有前途的工具，长期治疗遗传和获得性疾病。在细胞复制过程中，整合的序列被传递给子代细胞。插入突变导致肿瘤发生是公认的GT安全问题，这已在许多涉及体外用γ -逆转录病毒载体转导造血干细胞(Howeet al .,2008;Hacein-Bey-Abinaet al .,2008;布劳恩et al .,2014）.然而，这种风险的程度遵循其他载体类型，靶细胞和/或在活的有机体内管理方法尚不明确。了解与不同基因转移系统插入突变相关的风险因素是整个GT领域的一个至关重要的突出问题。靶细胞的性质、载体设计、给药方式和疾病背景可影响载体的插入特性，并可能影响肿瘤发生的可能性(Rotheet al .,2014;Chaungfenet al .,2011)。载体整合和克隆分析(测量细胞群中此类整合的多样性)是非临床和临床研究中GT产品安全性评估的标准工具。然而，最近强调了评估可能影响从诱变性事件向致癌性事件转变的其他因素(例如表观遗传因素)的必要性。

随着GT成为临床现实，对非临床试验的需求越来越大，以评估治疗策略对患者的安全性。一个健壮的在体外/硅评估插入突变/肿瘤发生风险的工具将支持风险评估，同时限制动物的使用。一些非临床分析(两者在体外而且在活的有机体内)用于评估GT方法的致突变性和致癌性。方法包括在体外永生化试验和Jurkat/LMO2细胞系模型。虽然这些是敏感的检测方法，但它们仅限于特定的癌基因、细胞谱系和/或遗传毒性机制。因此，它们更适用于通过特定机制筛选固有遗传毒性的新载体，而不是提供致癌风险的估计。

基于转基因载体直接局部或全身给药的GT主要是非临床支持的在活的有机体内在野生型啮齿动物或非啮齿动物物种中进行的研究，前提是它们与转基因插入、功能和生物分布相关。在某些情况下，缺乏转基因功能的KO小鼠可能有价值。治疗应用体外自体或异体细胞的基因修饰需要使用免疫功能低下的动物、疾病模型或易患肿瘤的动物(Montini, 2006;Modlich, 2009;蒙提,2012)。目前可用的所有模型在预测致癌风险方面都有局限性。为了进行GT研究，使用了特定的动物品系(例如，免疫缺陷NSG小鼠或特定疾病模型)，这些品系价格昂贵，产量低，需要特殊的控制屏障区域。此外，在这些情况下体外GT正在评估中，移植程序很复杂(需要骨髓取样，细胞纯化和体外转导)和许多动物“供体”被用来收集造血干细胞(hsc)。此外，监管机构有时要求进行连续移植，需要进一步使用受体动物。虽然这些非临床研究能够解决与载体设计相关的安全问题，但疾病环境的生物学相关性以及靶组织、细胞类型/谱系和分化状态对潜在遗传毒性的影响仅被部分探索(Aiutiet al .,2013)。

还有关于功效的考虑。为了使GT产品有效，基因校正细胞必须存在于足够高的水平，以实现治疗效果。关于非临床模型和患者中基因校正细胞间克隆优势的动态信息目前很少。对靶细胞插入谱的彻底评估和对治疗个体中基因校正克隆的克隆动态的全面跟踪将增加对临床结果的预测价值。

3 rs的好处

在开始人体试验之前，监管机构通常要求对GT产品进行动物试验在活的有机体内一般对每个GT产品进行研究。然而，个体整合载体的独特生物学特性意味着需要仔细考虑确定与临床结果预测相关的适当非临床研究。监管机构基于合理的科学和风险评估，期望制定一个量身定制的、适合目的的非临床开发项目(欧洲药物管理局，2009;Narayananet al .,2014）.对于某些GT产品，如果有大量的经验(非临床和/或临床)，可能会使用文献中的信息来免除在活的有机体内研究。然而，在所有情况下，特别是对于新载体，新的在体外/硅根据现有的非临床和临床数据验证的方法，将为减少动物研究的需要提供强有力的合理性。

• 作为一个例子，对于体外GT，一项典型的研究可能涉及将来自易患肿瘤的啮齿动物或疾病动物模型的对照和转导细胞移植到致命辐照的受体动物中，典型的研究至少涉及两组，小组规模通常超过30人(Montiniet al .,2012)。最多可使用100只啮齿动物，费用约在10万至30万英镑之间。然而，没有标准的研究设计，也可能需要大量的动物来提供供体细胞或在生成疾病动物模型的过程中。
• 根据欧盟动物保护法规，此类致瘤性研究中使用的程序通常属于中度至重度，可能包括:
  • 肿瘤易发供体细胞的分离。
  • 受体小鼠细胞的照射和移植。
  • 对受者进行血液取样以探讨移植效率。
  • 安乐死小鼠的肿瘤分析和载体拷贝数分析。

如果验证成功，一个在体外/硅早期描述可能与插入突变相关的安全性特征的平台可用于筛选载体，并提供早期进行/不进行的决策，避免需要在活的有机体内致瘤性和遗传毒性研究。如果广泛应用于未来的新型载体类型/血清型，对动物使用的影响将是最大的在活的有机体内还有体外基因治疗方法(O 'Reillyet al .,2012)。此外，本文还对该系统的发展和应用进行了展望在体外/硅该平台可以扩展到评估新兴技术的安全性，如基因编辑，这也带有插入突变的潜在风险。

第一阶段的获胜者

• 卢卡·比亚斯科博士，圣拉斐尔大学，售价84,115英镑。
• Axel Schambach教授，汉诺威医学院，10万英镑。
• 迈克尔·泰米斯博士，布鲁内尔大学，学费99,542英镑。

第二阶段的获胜者

项目团队领导:

Manfred Schmidt博士，GeneWerk GmbH£700000。

完整的挑战信息

评估信息

审查和质疑小组成员

由Mike Themis博士领导的团队，布鲁内尔伦敦大学与Manfred Schmidt博士合作，GeneWerk GmbH, Tübingen大学自然与医学科学研究所，伦敦大学学院和伦敦国王学院开发了世界上第一个人类诱导多能干细胞(iPSC)。在体外基因毒性测试平台(^hInGeTox)来评估基因治疗载体的安全性，以减少对动物的依赖在活的有机体内肿瘤遗传学和遗传毒性研究。

该平台利用广泛接受的人类载体介导肿瘤发生驱动因素的生物标记物，分析了基因治疗(GT)载体的遗传毒性。的^hInGeTox细胞平台利用了人类诱导多能干细胞(iPSc)的无限增殖能力，具有重编程到人体内几乎任何终分化细胞的潜力，并为基于基因毒性的分子分析的风险评估提供了足够的材料。的^hInGeTox原型平台使用iPSc在3D中分化成肝细胞，因为肝脏是药物毒理学测试最常见的靶器官。肝脏也被证明易受化学制剂和基因治疗载体诱导的肿瘤发生的影响。该细胞培养平台可在短短30天内分析基因治疗载体的副作用，或可延长至700天，相当于长期克隆跟踪研究小鼠的寿命。

测量导致基因毒性的载体相关因素，包括通过S-EPTS/LM-PCR进行的载体整合位点(IS)定位，载体启动子或增强子引起的癌症基因表达变化，基因剪接或载体读通导致的载体和基因之间新截断的形成，以及基因转移后宿主基因组和治疗载体的表观遗传变化。

的^hInGeTox多维载体安全性表征系统提供了真实的灵敏度，是一种适用于慢病毒(LV)和腺相关病毒(AAV)载体测试的多功能平台。

现有的GT产品监管指南要求，载体介导的基因毒性的临床前测试应证明对研究性GT产品的生物反应与人类的预期反应相似。^hInGeTox提供了一种可靠的基于人体的系统，避免了在不朽细胞系和动物模型上进行测试时与载体相关的转化和肿瘤发生的通常偏差。此外,^hInGeTox提供风险评估的时间比长期的动物研究要短得多，取代了动物的痛苦，显著降低了成本，在道德上是可以接受的。^hInGeTox的开发是为了提高人们对GT产品的信心，并加速其在临床中的应用。

布鲁内尔大学的团队建立了TestAVec有限公司作为一家分拆出来的公司^hInGeTox作为GT生产商在开发期间的非临床病毒载体安全性评估服务，以降低GT产品的制造成本。TestAVec团队与GeneWerk密切合作，继续与挑战赞助商、GSK和诺华合作开发^hInGeTox战略进一步深入到GT领域的关键应用中。

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