都灵大学兽医科学系的研究人员开发了急性和器官典型培养脊髓切片制剂(SCSPs)来研究疼痛。这体外解决方案可以从每只动物中获得多个切片，因此减少了每次研究所需的动物数量。研究人员正在寻找合作伙伴，以帮助进一步开发和验证用于研究痛觉和神经炎症的创新SCSPs体外,以及新疗法的临床前开发。
有了CRACK IT Solutions的资助，Merighi教授现在正与英国切斯特大学尤斯塔斯·约翰逊教授领导的团队合作。他们将共同使用脊髓切片平台模型研究间充质干细胞/间质细胞移植到脊髓的效果，更好地了解其对神经炎症、中枢神经性疼痛和神经元高兴奋性的影响。
控制疼痛是临床医学的一大挑战。目前在疼痛和神经炎症领域的研究也在进行在活的有机体内或者在分离细胞上培养体外。动物模型用于了解生理性和/或病理性疼痛的机制，并且总是与严重的痛苦有关。这些实验通常在啮齿动物身上进行，不仅需要通过不同的物理或化学方法诱导疼痛，而且，特别是在研究神经性或慢性疼痛时，还会诱导神经损伤的产生，导致长期的疼痛过敏。虽然工作在活的有机体内这些在活的有机体内模型在技术上要求很高，并且在个体和实验组之间的痛感反应中存在高度的可变性。此外，药物生物利用度可能难以控制，某些物质无法通过血脑屏障，因此需要脊髓鞘内给药，增加了复杂性和福利负担。这些缺点中的许多都可以用培养的原代神经元和/或神经元细胞系来克服，但是这种方法丢失了电路，使得它不适合研究细胞间的通信和神经信号的调制。
为了克服这些困难，研究人员开发了急性和器官典型培养的脊髓切片，并证明它们可以为痛觉和神经炎症的中心机制提供独特的见解。瞬时受体电位离子通道香草素亚家族成员1 (TRPV1)对外周组织炎症的发生至关重要。研究人员描述了脊髓切片对辣椒素(TRPV1的一种天然激动剂)刺激的反应et al。(Frias和Merighi, 2016)，并证明了其在中枢神经元急性炎症模型中的有效性。
参考文献
- 王晓燕，王晓燕，王晓燕(2014)。脊髓切片Fos和pERK免疫反应性的比较分析在体外测试假定的抗感受器分子的模型。解剖学年鉴-解剖学家Anzeiger196(4): 217 - 23所示。doi: 10.1016 / j.aanat.2013.11.005。
- 弗里亚斯B, Merighi A(2016)。辣椒素，痛觉和疼痛。分子(6): 797。doi: 10.3390 / molecules21060797。
- 毛J(2012)。翻译性疼痛研究目前面临的挑战。趋势杂志Sci33(11): 568 - 73。doi: 10.1016 / j.tips.2012.08.001。
研究人员开发了急性和器官典型培养的产后(P7-P10)和年轻人(P30)脊髓切片制剂来研究疼痛。捐赠者的年龄是至关重要的et al .,2016)，因为啮齿动物的痛觉系统在P21左右成熟。培养未成熟和成熟组织的可能性为研究神经回路的可塑性及其对炎症的反应提供了独特的机会。脊髓切片作为中枢疼痛信号研究平台的制备和使用原理如图1所示。
切片逐渐成为主流在体外电生理学家使用的制剂，组织学家、药理学家和生物化学家在较小程度上使用的制剂，因为它们保留了起源组织的细胞结构。由于基于切片的检测系统可以精确控制细胞外环境，它们有助于研究旨在建立结构和功能之间的明确相关性，以及不同实验条件下神经元相互作用的可塑性。
培养物可以受到炎症的挑战，一、二级痛觉神经元之间的突触的反应可以通过其体的大容量钙成像、膜片钳电生理记录或早期基因(fos/erk)激活的量化(Salioet al .,2014)。可通过免疫化学程序(如ELISA或免疫细胞化学)监测有害感受器的释放(Salioet al .,2014)。值得注意的是，该系统可以通过使用物理转染方法(基因枪)的基因工程进一步操纵，至少在一定程度上避免了产生新的转基因菌株的需要，进一步减少了在这些研究中使用动物。研究人员开发了一种体外基于fret的程序，监测切片制备中caspase - 3依赖性神经退行性变，并可用于测试持续炎症对神经元存活的影响(Alasiaet al .,2015;Lossiet al .,2016)。
该系统也适用于药理学培养基通量筛选，因为切片可以与表达炎症因子受体的生物传感器细胞系(“嗅探细胞”)共培养(图2)。这种方法对于测试中央释放的炎症介质的生理相关性至关重要，因为它提供了诱导功能相关反应的能力的线索在活的有机体内．来自人类诱导的多能干细胞的神经元也可以用作生物传感器“嗅探器”细胞，以获取关于人类神经元对片源性炎症介质反应的重要翻译信息(Ghoochaniet al .,2016)。
参考文献
- Alasia S, Cocito C, Merighi A，等．(2015)。荧光共振能量转移(FRET)实时可视化caspase-3激活。:神经细胞死亡。分子生物学中的方法(方法和协议)，卷1254。(作者:losi L, Merighi A)，纽约:Humana出版社/施普林格科学+商业媒体。doi: 10.1007 / 978 - 1 - 4939 - 2152 - 2 - _8。
- Ghoochani A, Yakubov E, Sehm T，et al。(2016)。一个多才多艺的体外脑部肿瘤血管生成和小胶质细胞的检测技术。Oncotarget7(2): 1838 - 53年。doi: 10.18632 / oncotarget.6550。
- Jackson SJ, Andrews N, Ball D，et al。(2016)。年龄有关系吗?鼠龄对研究结果的影响。实验动物51(2): 160 - 169。doi: 10.1177 / 0023677216653984。
- losi L, Cocito C, Alasia S，et al。(2016)。体外用基于fret的分子探针成像活性caspase 3，显示了小脑颗粒细胞中蛋白酶的细胞动力学和定位，以及凋亡抑制蛋白survivin对其的调控。分子神经退化11(1): 1 - 20。doi: 10.1186 / s13024 - 016 - 0101 - 8。
- Salio C, Ferrini F, Muthuraju S，et al。(2014)。神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)对脊髓痛觉传递的突触前调节。J >34(41): 13819 - 33所示。doi: 10.1523 / jneurosci.0808 - 14.2014。
寻求与学术界和/或制药和生物技术公司合作，以:
- 扩大(例如通过使用微流体培养系统)和验证用于临床前药物开发和精准医疗的SCSPs。
- 提供一个更大的候选疼痛控制药物/分子面板，可以测试和入围，以进一步开发使用SCSPs。
- 探索切片模型在研究疾病模型方面的效用，例如使用EAE小鼠的脊髓来研究多发性硬化症。
在合作项目/风险的框架中，研究人员提供:
- 用研究人员的SCSPs测试任何感兴趣的化合物的可能性。
- 来自中枢神经系统其他区域的切片平台的开发(出生后小脑切片已经在实验室中常规使用)用于神经退行性变的研究。
- 老年大脑切片平台的开发。
使用SCSPs有可能减少实验中使用的动物数量，因为可以从每只动物身上获得多个切片，因此减少了每次研究所需的动物数量。例如，在P4小鼠脊髓解剖后，可以很容易地获得20片(400 μ m厚)。可以在多孔板的每孔中培养多个切片，从而对从同一动物获得的SCSPs进行不同的实验/药理学挑战(图3)在活的有机体内该方法中，每组使用8只小鼠，四组进行研究，SCSPs有可能将使用的小鼠数量从32只减少到8只。该技术还提供了一种新的中等通量筛选平台，适用于疼痛靶向疗法的临床前开发。
通过避免专门产生新的转基因小鼠品系，所需的动物数量可以进一步减少。SCSPs可以瞬时转染以表达一种或多种感兴趣的蛋白质，这样就不需要为某些实验培育转基因动物了。
概述
有了CRACK IT Solutions的资助，Merighi教授现在正与英国切斯特大学尤斯塔斯·约翰逊教授领导的团队合作。他们将共同使用脊髓切片平台模型研究间充质干细胞/间质细胞移植到脊髓的效果，更好地了解其对神经炎症、中枢神经性疼痛和神经元高兴奋性的影响。该系统有可能将用于这些研究的动物数量减少50%，因为可以从一只动物身上培养出多个切片。
影响
使用振动器从CD1小鼠(出生后第7 / 8天，雌雄)中取350 μ m厚的脊髓切片，与ST2细胞(小鼠骨髓来源基质细胞系)或ST2细胞条件培养基(ST2- cm)共培养72小时。ST2细胞在神经基础培养基中培养3天，获得条件培养基。下图1显示，与仅暴露于ST2- cm的脊髓切片细胞相比，与ST2细胞共培养的脊髓切片细胞的细胞核中，c-fos的表达增加，这是一种神经元激活的标记物。这表明与ST2细胞共培养在重建丢失的电路和激活脊髓神经元方面可能比条件培养基更有效。然而，由于需要确定移植到脊髓切片上的ST2细胞的最佳数量，因此在技术上很难直接比较共培养细胞和条件培养基。因此，本研究继续只研究ST2-CM。
图1:有机型小鼠脊髓培养物中c-fos的表达对照组(A)在ST2- cm中培养72小时(B)或与ST2细胞共培养72小时(C)。
为了进一步研究神经元活性，我们对脊髓切片中ST2-CM培养72小时后的单个神经元进行膜片钳实验。图2的结果表明，与ST2-CM共培养的脊髓切片神经元的放电频率和兴奋性突触后电流幅值均有所增加。这些数据表明ST2-CM通过保持和加强局部突触的连接和传输促进脊髓切片中的神经元活性。
图2:对照介质和ST2-CM中神经元的膜片钳记录。一个-B:对照组(蓝色，n=15)和ST2-CM(红色，n=4)中40pa去极化步骤诱导的放电活性。C:电流级从-40到120 pA诱导的发射频率。平均频率:15.06±4.14 Hz(对照组)和36.57±4.44 Hz (ST2-CM;双尾t检验,p = 0.0103)。D:对照组(蓝色，n=17)或ST2-CM(红色，n=5)中记录的兴奋性突触后电流幅值的累积图。ST2-CM诱导分布右移，表明兴奋性突触后电流幅值增加(Kolmogorov-Smirnov检验，P<0.001)。
对脊髓切片中的神经元进行钙成像实验，以同时分析更多数量的神经元，探索整个神经元网络的活性和连通性。结果表明，对照组和ST2-CM处理的培养物都表现出自发的钙活性，形式为孤立的钙瞬变或爆发活性(图3A-B)。然而，在ST2-CM存在的情况下，细胞爆发活性显著增强，这表明暴露于STC-CM后细胞内钙振荡的模式被修改。这再次表明，神经元的连通性可能有所改善，因为网络似乎更加活跃。需要做进一步的工作，以确定哪些生物介质存在于驱动这些反应的条件培养基中，但这些数据表明它们以活性浓度存在。
图3:对照培养基和ST2-CM中的钙成像。控制组神经元的爆发样活动记录(一个)及ST2-CM (B）.C:对照组(n=11)和ST2-CM (n=18) - Mann-Whitney检验，p=0.0016。D:对照组和ST2-CM的活动模式。
总之，数据表明ST2细胞和ST2- cm促进脊髓网络中的神经元活动，影响网络活动的节律性并增加局部突触连通性。ST2-CM是损伤后修复的有希望的底物，因为神经元之间强大的突触连接是组织修复的一个重要因素。同样，移植的ST2细胞在c-fos免疫染色后似乎能够激活脊髓神经元。ST2移植细胞对神经元活性的影响仍在研究中，以优化细胞剂量，然后将结果与ST2- cm的结果进行比较。
项目期间获得的知识改变了这两个机构用于研究脊髓生物学的方法。联合培养的实施使都灵大学的研究人员扩大了他们对脊髓切片的使用，合作者已经从严重的在活的有机体内脊髓损伤模型体外这里描述模型。一般来说，每只老鼠可以获得10到12片切片，既可以用于对照组，也可以用于治疗组，这大大减少了所需的动物数量。在本报告的实验中，使用了8只幼鼠，而研究人员估计同样的实验在活的有机体内，需要大约60只动物(即每一种技术方法有10只动物作为对照，10只作为治疗)。
出版
王晓燕，王晓燕，王晓燕(2018)。的使用体外关注3Rs哲学的神经科学转化研究中的啮齿类动物平台。前面。兽医。科学。5:164。doi.org/10.3389/fvets.2018.00164。
