blb试验是一种便携式、自动化的BoNT检测方法，可替代小鼠杀伤力生物测定(MLB)。BLB-Test被集成到一个微流体平台中，该平台包含了所有用于检测的试剂，BLB-Test的编程操作从笔记本电脑完成。该方法可在缓冲介质和复合介质中区分和定量所有已知致病BoNT血清型。寻求与有兴趣帮助在广泛的可能被BoNT污染的复杂基质上验证BLB-Test的最终用户或有兴趣生产和商业化BLB-Test的公司建立伙伴关系。
通过CRACK IT Solutions, Stevens博士目前正在与多个欧洲合作伙伴进行一个解决方案资助的项目，以验证BLD-Test，以便成功地改造和开发它以取代小鼠生物测定法。
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肉毒中毒是一种潜在的致命瘫痪，由BoNT阻断神经递质释放。据估计，8种BoNT血清型的LD50为1纳克/公斤体重，共细分为40多种亚型，是已知的毒性最大的天然物质。
最广泛接受的BoNT检测方法是MLB (Dorner MB)等, 2013)。这有一个灵敏度，取决于BoNT类型，10-100 pg/mL (Dorner MB等, 2013)。在本试验中，小鼠腹腔内注射一种怀疑含有BoNT的溶液。需要观察呼吸困难、四肢无力和最终死亡等症状，以确认BoNT的存在。MLB要求1-4天的读出时间;使用大量小鼠(> 100)进行血清分型和精确定量;毒性取决于使用的小鼠的年龄和品系，导致敏感性的变化(Dorner MB等, 2013)。为了克服这些限制，在体外BoNT测定法已经开发出来。其中最常用的是基于elisa的。
尽管一些以实验室为基础的免疫分析方法是高度敏感和特异性的，但它们需要大量的特异性高亲和力抗体来可靠地检测越来越多的已知亚型(目前超过40种)，并且可能遗漏新的血清型，从而产生假阴性结果(Dorner MB)等, 2013)。目前还没有一种免疫分析法能够检测所有的BoNT亚型。尽管一些免疫测定法具有4-6小时的高灵敏度，但它们不太可能区分活性和非活性BoNT (Dorner MB)等, 2013)。
其他在体外BoNT检测包括内肽酶检测和基于细胞的检测，两者都可以检测BoNT，其灵敏度超过MLB。然而，由于需要高度复杂的设备和技术，这些分析是基于实验室的，需要受过高度训练的人员来提供可靠的结果(Dorner MB等, 2013;Pellett年代2013)。
参考文献
- Dorner MB, Schulz KM, Kull S，等．(2013)。肉毒杆菌神经毒素的复杂性:检测技术的挑战．Curr Top微生物免疫364: 219 - 55。doi: 10.1007 / 978 - 3 - 642 - 33570 - 9 - _11
- Pellett年代(2013)。基于细胞的检测方法的研究进展肉毒杆菌神经毒素检测柯顶微生物免疫364: 257 - 85。doi: 10.1007 / 978 - 3 - 642 - 33570 - 9 - _12
BLB-Test(史蒂文斯GB等.， 2013)，由固定的多肽连接报告分子。多肽被BoNT切割，释放被光学读出的报告分子。该方法检测BoNT轻链域的内肽酶活性，从而只检测出活性的BoNT，避免了BoNT不活性引起的潜在假阳性。BLB-Test能检测和区分所有致病BoNT血清型:A、B、C、D、E、F，以及混合型H/F5、A/B、A/F、B/F、B/H，以及与之密切相关的破伤风神经毒素(TeNT)。
blb测试中使用的多肽是基于BoNT的天然底物，形成神经元的SNARE复合体。不同的BoNT血清型在SNARE复合体上有特定的切割位点，因此这些多肽氨基酸序列的修饰可以区分不同的血清型。与非靶向血清型的交叉反应可以忽略不计，因此为肉毒中毒患者的靶向治疗提供了高度特异性的检测。
BLB-Test的BoNT检测是自动化的，只需最少的培训/专业知识就可以完成:液体样品或固体提取液被分散到微流体盘中，然后装入磁盘阅读器(van Oordt T等, 2013)。在操作过程中，计量量的样品被分配到每个反应室，在孵育期后根据所需的灵敏度进行分析。分析后，包含标本的一次性使用盘可以安全销毁。目前仍在评估blb试验在各种基质中对所有已知致病血清型的敏感性。然而，BoNT/A的检测限为40 fM (6 pg/mL) (Stevens GB)等.， 2013)，这与MLB (Dorner MB .)的灵敏度相当等, 2013)。
BLB-Test在检测和区分致病BoNT血清型方面的高灵敏度和能力，应使其有助于对人类和动物、食品和环境样品的分析。BLB-Test可以在不需要样品预处理的情况下检测复杂基体中的BoNT。到目前为止，成功测试的原料包括血浆、牛奶、肉汤和胡萝卜汁。因此，它可广泛应用于安全、食品安全和保健服务。
参考文献
- Dorner MB, Schulz KM, Kull S，等．(2013)。肉毒杆菌神经毒素的复杂性:检测技术的挑战．Curr Top微生物免疫364: 219 - 55。doi: 10.1007 / 978 - 3 - 642 - 33570 - 9 - _11
- 史蒂文斯GB，西尔弗DA, Zgaga-Griesz A，等．(2013)。高灵敏度肉毒杆菌神经毒素活性的生物发光测定法．分析师138(20): 6154 - 62。doi: 10.1039 / c3an00525a
- van Oordt T, Stevens GB, Vashist SK，等．(2013)。快速和高灵敏度的荧光素酶报告检测自动检测肉毒杆菌毒素在离心微流体LabDisk平台．RSC的进步3(44): 22046 - 22052。doi: 10.1039 / C3RA44482A
寻求与有兴趣帮助彻底验证BLB-Test在广泛范围内可能被BoNT污染的复杂矩阵上的最终用户的合作关系。这些包括病人样本、环境样本、食品和饮料、动物饲料、园艺产品等。合作伙伴最好在兽医或农场环境、医院实验室、制药公司、政府检测实验室或军队或紧急服务机构拥有BoNT检测的专业知识。
研究人员希望与有兴趣生产和商业化BLB-Test的公司建立合作关系，特别是那些在生产、分销和营销“需求点”诊断或生物分析方面有经验的公司。
最后，寻找具有细胞膜和受体生物化学专业知识的机构合作者，并有兴趣加入该团队申请研究资助。研究人员建议将BLB-Test扩展到检测BoNT与膜受体的结合，以及通过核内体膜中形成的孔来检测BoNT的蛋白水解轻链结构域的易位。
MLB广泛用于检测怀疑含有BoNT的产品和样品。根据德国标准DIN 10102和AOAC官方方法977.26 (Dorner MB等．2013年),在活的有机体内测试策略要求每个BoNT包含样本最多20只小鼠(即为每个样本完全血清型的>140只动物)。据估计，2009年全球约有60万只小鼠被用于诊断和制药目的(Bitz S 2010)。该试验方法对动物造成严重的痛苦，可使动物在长达4天的时间内因缓慢窒息而死亡。
在目前的形式下，blb测试可用于在大多数情况下取代MLB，因为它可以检测、区分和量化已知在人和动物中引起疾病的所有血清型(BoNT A-F)。BoNT/G与疾病无关(Dorner MB等.， 2013)，目前不能用BLB-Test检测到目前可用的浓度。然而，由于BoNT-G分裂的底物多肽与BoNT-B相同，原则上它也应该在毫摩尔浓度下被检测到。总之，BLB-Test具有在复杂基质中区分主要BoNT血清型的能力，有可能大幅减少用于测试BoNT血清型标本的小鼠数量。
参考文献
- 来自主办国的年代(2010)。的肉毒杆菌神经毒素LD50试验-问题和解决办法．替代动物实验．27(2): 114 - 116。
- Dorner MB, Schulz KM, Kull S，等．(2013)。肉毒杆菌神经毒素的复杂性:检测技术的挑战．Curr Top微生物免疫364: 219 - 55。doi: 10.1007 / 978 - 3 - 642 - 33570 - 9 - _11
概述
通过CRACK IT Solutions, Stevens博士目前正在与多个欧洲合作伙伴合作，包括学术界、小公司和政府组织，开展一个验证bld测试的项目，以便成功地改造和开发它，取代小鼠生物测定法。这项由CRACK IT解决方案资助的研究将描述、验证和记录生物测定的性能，以便用户和监管机构对BLD-Test区分和检测复杂生物基质中不同浓度BoNT的能力有很高的信心。
影响
Greg与8个合作伙伴合作，包括来自德国的4个合作伙伴——toxogen、QIAGEN Lake Constance、Hahn-Schickard研究所和公共卫生Robert Koch研究所，以及英国国家生物标准和控制研究所，对bld测试的性能进行了描述和验证。在bld测试的一项国际环试验中，五个参与实验室仅在3小时内就能识别血清、豆汁和胡萝卜汁中不同浓度的含bont样本(不需要血清分型)，而小鼠生物测定则需要长达24小时。
每年约有60万只小鼠用于BoNT标本的筛选和血清分型，并用于评估用于治疗目的的肉毒杆菌产品的安全性。应用bld试验可大大减少用于诊断的小鼠数量。基于环试验的结果，Greg、Hahn-Schickard和toxogen继续合作进一步提高BLD-Test的敏感性、特异性和稳定性，目的是将其作为小鼠生物测定的一种替代方法进行营销。BLD-Test受欧洲和美国专利保护。
出版物
Weisemann J等人(2016)。一种用于血清分型和肉毒杆菌神经毒素检测的无抗体的功能测定法。Toxicon 123: S84。doi: 10.1016 / j.toxicon.2016.11.231
Stevens GB, Zgaga-Griesz A, Silver DA, Krueger M, Urban GA 2017，肉毒梭菌神经毒素检测，EP 2 764 115 B1
Stevens GB, Zgaga-Griesz A, Silver DA, Krueger M, Urban GA 2018，肉毒梭菌神经毒素检测，USPN 10,131,933
