Affimer蛋白直接替代二抗

我们为什么要资助这个项目?

该奖项旨在用Affimer蛋白替代哺乳动物产生的第二抗体，如山羊、绵羊和驴在体外．

抗体用于广泛的应用，包括临床前研究，以确定特定的目标和纯化蛋白质。可以产生一抗在体外然而，二抗通常在动物中产生，主要是山羊、绵羊或驴子。对动物进行免疫并放血，以便采集产生的抗体。这可能会在动物的一生中重复多次。以这种方式产生的抗体可以识别抗原上的多个目标，增加信号并减少实验中的背景噪声。克里斯蒂安·提德博士和他的同事之前已经开发出Affimer蛋白，这种蛋白与目标分子结合的特异性和亲和性与动物源抗体相似。这些工程蛋白可以被生产出来在体外到目前为止，已经被用来靶向500多种不同的蛋白质。

学生将Affimer蛋白分离到小鼠和兔子抗体的固定区域，产生与二抗作用相似的Affimer蛋白。然后将它们融合到辣根过氧化物酶或荧光团中，并在抗体使用常见的技术中进行测试，如elisa、western blotting和免疫组化。学生还将发展蛋白质生产和噬菌体展示的技能。

抗体是科学、医学研究和诊断中不可或缺的工具。对抗体与靶分子结合的敏感检测，一般需要对检测信号进行放大。这通常涉及一抗和二抗的两阶段检测过程。一抗直接结合到目标抗原，而二抗体，通常结合到酶检测，结合到一抗的恒定区域。虽然一抗通常是单克隆的，并在CHO细胞培养中重组产生，但二抗通常是多克隆的，因此只在哺乳动物中产生，主要是山羊、绵羊或驴。除了与动物使用相关的伦理问题，交叉反应性问题和批次之间的变异阻止了良好生产规范所要求的标准化生产。到目前为止，在减少动物二抗产生方面只做了有限的尝试，而且还没有商业化的替代品。

我们的目标是用在体外选择Affimer蛋白，重组产生大肠杆菌．Affimer protein的建立是一种多功能的结合蛋白试剂，可以在许多应用中取代抗体。Affimer蛋白具有发育时间短(2-4周)、高亲和力、高稳定性和高表达量等特点大肠杆菌．此外，它们可以通过生物素、荧光团或与酶的基因融合进行位点特异性标记，并可以生成单特异性或双特异性Affimer结构。迄今为止，通过噬菌体展示，我们已经成功地筛选了500多种蛋白质、肽或化学物质的初级Affimer蛋白。它们的应用已经在eLife, Blood, PNAS, EMBO, Science Signalling, Molecular Cell和Nature Structural & Molecular Biology等期刊的高影响力的出版物中得到证实。

我们将应用噬菌体展示分离Affimer蛋白到小鼠和兔抗体的恒定区域，并对人片段结晶(Fc)进行反向选择。将测试所选的结合剂在固定区域上与不同表位的结合，目的是尽可能多地选择唯一的表位结合剂。获胜的候选抗体将被融合到人类Fc区域，使其二价，因此类似于二价抗体。将产生Affimer- Fc融合蛋白，然后用辣根过氧化物酶或荧光团标记。它们检测一抗的能力将通过酶联免疫吸附试验、western blotting和免疫组织化学与市售二抗的直接比较进行测试。

我们的方法寻求替代和减少用于二抗生产的动物。我们建议的二次试剂的成功实施仅在英国每年就可以节省760多条哺乳动物。Affimer蛋白质提供了一种真正的抗体替代品。我们之前的工作已经表明Affimer蛋白可以在许多应用中直接取代一抗。这一提议代表了我们迄今为止所做努力的延续，也是使用Affimer技术取代二抗的第一次尝试。我们的长期目标是实施2010/63/EU指令，该指令要求，如果存在非动物替代品，动物不得用于科学目的。