利用CRISPR-Cas9系统进行肠/结肠类器官(小肠道)培养的基因筛选

项目背景

通过泛素-蛋白酶体系统降解蛋白质是调节蛋白质活性的关键细胞机制。该通路的特异性是由F-box蛋白授予的，到目前为止，在小鼠和人类基因组中已经发现了70多个F-box蛋白。许多关键途径，如细胞生长/生存/死亡都由F-box蛋白调控，这些蛋白质的突变通常与癌症有关。大约10%到15%的结直肠癌都有一种常见的F-box蛋白突变。由于这种蛋白质家族的大小，对这些蛋白质的遗传研究是不完整的在活的有机体内由于敲除突变的胚胎杀伤力，研究并不总是可能的。

我们为什么要资助它

这个博士研究生项目的目的是用3D代替转基因(GM)小鼠来研究F-box蛋白在体外肠道类器官培养。相关突变将通过CRISPR/Cas9基因组编辑系统引入。

含有相关纯合突变的转基因小鼠每年大约需要400 - 500只小鼠。Shams Nateri博士预测，还需要400到500只老鼠进行功能实验，以确定移除感兴趣的F-box蛋白的效果。的使用在体外类器官模型和基因组编辑系统有可能取代这些研究所需的所有小鼠。

研究方法

由于干细胞不能分化为完全成熟的肠上皮细胞，3D肠类器官比2D单分子干细胞模型更能真实地复制肠道生理学。一种新的基于荧光/发光的筛选系统将用于敲除类器官的创建。该系统的使用将允许创建一个大规模的类器官文库，对F-box蛋白进行靶向编辑。从这个库中派生出的任何表型都可以被充分探索，并确定其归属突变。与2D模型相比，3D肠类器官的复杂性增加，也使该模型有可能用于药物筛选研究。

在翻译后时间尺度上调节许多蛋白质活性的关键细胞机制之一是利用泛素-蛋白酶体系统进行蛋白质降解。蛋白水解对任何特定底物的特异性是由其与特定e3受体亚基的结合决定的。F-box蛋白是e3 -泛素连接酶的底物识别成分。人类和老鼠的基因组包括70-75个F-box蛋白质，这些蛋白质尚未被完全研究。

由于敲除小鼠的致命性，在体内分析基因功能并不总是可能的。该实验计划将使用之前开发的体外3D类器官培养物来研究E3s的功能。慢病毒基因过表达和CRISPR/Cas基因组编辑技术将用于类器官基因的修饰。

我们的目标是;

1)结合CRISPR/Cas系统开发一种新的基于荧光/发光的类器官敲除筛选方法。我们将应用这种方法来分析肠道干细胞中富集的FBXW7-E3的功能缺失表型。

2)我们将通过一个靶向f -box型e3 -ligase的表达grna的类器官文库，建立大规模的CRISPR/ cas介导的类器官培养突变。可诱导的Cas9重组酶可在类器官中产生位点特异性突变。例如，我们将这些类器官筛选生长、增殖和分化所必需的e3。突变克隆中的gRNAs将被测序，负责表型的基因将被识别。

主要目标是:

i)建立类器官培养中功能性遗传工具的CRISPR/Cas和荧光/发光筛选体系

ii)了解f -box型E3-ligases的作用。

本研究将为类器官培养提供有用的遗传工具，并将证明的有效性在体外研究基因功能的系统。小鼠遗传学家将被鼓励使用类器官培养物作为在活的有机体内研究。