CRISPR-CAS工程秀丽隐杆线虫和患者派生的IPCSS中与DAT/SLC6A3突变相关的多巴胺转运蛋白功能障碍的调查

我们为什么为这个项目提供资金？

该奖项旨在使用线虫蠕虫秀丽隐杆线评估最近鉴定出帕金森氏症表型患者的遗传变异，在某些研究中为使用小鼠的使用提供了替代方案。

人类多巴胺转运蛋白的SLC6A3基因代码是多巴胺能神经传递的主要调节剂。SLC6A3中的突变与多种疾病有关，包括多巴胺转运蛋白缺乏综合征，这是一种罕见的运动障碍，呈现出帕金森氏症表型，包括肌张力障碍。在帕金森氏症表型患者中，SLC6A3中的十个错义变异突变已被发现，发病和严重程度各不相同。但是，这些变体如何影响多巴胺转运蛋白的功能以及多巴胺能信号传导是未知的。两个都体外和体内遗传修饰的实验用于研究多巴胺信号传导，以更好地了解突变的影响。但是，多巴胺转运蛋白缺乏综合征是一种退化性疾病，难以准确模拟体外由于细胞通常不会模仿衰老。秀丽隐杆线可以为使用脊椎动物的动物提供替代品，因为基于当前的科学思维，它被认为没有能力遭受痛苦。许多人需要多巴胺能信号传导秀丽隐杆线行为，它还具有SLC6A3的直系同源物，使其在科学上具有吸引力。

与Eva Kevei博士一起的学生将使用CRISPR/CAS9进行基因修改秀丽隐杆线并引入患者确定的七个错义变异。然后，他们将通过行为测定（例如监测运动性和运动）来评估多巴胺控制的功能，以确定突变对多巴胺能信号的影响。学生将通过评估SLC6A3的功能并同时处理细胞和治疗细胞的功能来验证人IPSC模型中的发现秀丽隐杆线具有药剂伴侣的模型，导致错误折叠蛋白正确折叠的分子疗法，可有效挽救SLC6A3缺陷。学生将发展基因工程，荧光显微镜和秀丽隐杆线生长和操纵。

多巴胺转运蛋白缺乏综合征（DTDS）是由人多巴胺转运蛋白DAT/SLC6A3引起的常染色体隐性帕金森氏病。SLC6A3是一种膜共旋蛋白蛋白，在突触前膜上将多巴胺内在化和Na+/Cl-转运耦合，并且是多巴胺能神经传递的主要调节剂，与包括自闭症（ASD）和ADHD（ASD）和ADHD在内的各种人类神经疾病的相关性。最近，已经确定了10种新的错义变体，这些患者呈现出更广泛的帕金森氏症表型，疾病的发作和严重程度各不相同。然而，目前尚不清楚这些突变对SLC6A3及其生物体对多巴胺能信号传导的广泛后果的影响。

为了研究SLC6A3连接的疾病机制，我们将通过CRISPR-CAS工程建立新型DTD的新型DTD模型，该工程在内源性的Caenorhabditis elegrans ortholars orthologue dat-1中为7个新的错义变体建立。在人类中，多巴胺调节了一系列行为反应和运动控制，其中大多数在整个进化过程中都是保守的。学生将验证DTDS Dat-1突变对多巴胺控制行为和运动功能的影响，并监测神经毒素诱导的多巴胺能神经元变性秀丽隐杆线。为了验证他们的发现，学生将测试所选疾病SLC6A3变体在DTD的中脑多巴胺能神经元模型中的影响，它们将从患者衍生的诱导多能干细胞（IPSC）中发展。学生将通过研究突变多巴胺能细胞中的SLC6A3功能，多巴胺毒性，神经变性和炎症来评估基础疾病的细胞机制。这将通过治疗多巴胺能神经元和秀丽隐杆线具有药剂体的模型，可有效挽救相关的SLC6A3折叠缺陷。

建模DTD主要依赖于人类细胞培养技术和小鼠模型。测试多巴胺运输的改变体外不容易转化为人脑的帕金森氏症表型。Mice Slc6a3/DAT knockout analysis, of which yearly 3-4 studies are published with the use of around 100 mice/study (PMID:34011628), highlighted the essential role of SLC6A3 in dopaminergic brain function but did not convey data on the patients’ missense variants. Knock-in (KI) approach, providing more accurate data on patient alleles, has recently gained momentum, and thus far 5 KI mouse models have been generated for investigating the impact of missense variants in SLC6A3. These studies used an estimated 300 mice/per study to generate and characterize the KI models. The lack of fast, cheap体内评估SLC6A3变体数量增加的影响的模型确定了功能分析和潜在治疗方法的发展缓慢且效率低下。在这里，我们建议快速将7种新疾病变体引入秀丽隐杆线SLC6A3的直系同源物，取代了开发Ki鼠标模型的需求。线虫模型中获得的结果将转化为患者IPSC模型，以进行立即治疗研究。因此，我们估计该项目中该项目中2100只动物的替代。什么时候秀丽隐杆线Ki模型应用于其他SLC6A3连接的神经条件，例如ADHD或ASD，我们的替换策略将对3R造成更大的3R撞击，从而进一步减少使用小鼠的使用，并有可能在SLC6A3连接的疾病上替换每年的300-400只动物全球研究。考虑到目前尚无DTD的治疗，快速体内结合药理学伴侣和IPSC的建模将为我们理解患者新型SLC6A3变体的功能后果提供强大的方法。