3Rs方法评估早期妊娠哺乳动物胚胎体外药物毒性

对于孕妇或试图怀孕的女性来说，重要的是要意识到她们在怀孕期间可能不得不服用的任何药物所带来的风险。这在妊娠的前三个月尤其重要，那时胚胎对发育缺陷最为敏感。给女性的一般建议是在怀孕期间根本不要服药，只有当对母亲的好处大于对胚胎的潜在影响时，才建议医疗专业人员开处方。这表明需要充分了解当前和新药物在怀孕期间的效果，特别是在治疗某些疾病(如癫痫、艾滋病毒)时，停止治疗可能是不谨慎的。由于不能用孕妇来测试药物在怀孕期间是否有害，我们必须在临床前测试中依赖动物的结果，在临床前测试中使用了数百万只动物(其中很大一部分是啮齿动物)，因此测试非常昂贵。不幸的是，这些发育和生殖毒性研究(DARTs)在预测人类发育毒性方面的准确性仍然未知，在动物试验中没有任何影响并不一定意味着药物在怀孕期间是安全的。尽管这是经过验证的在体外替代方案，这些都不能提供一个综合的方法来观察早期发育的胚胎。

我们开发了一种新型的3D组织培养方案，使用悬浮生长的少量小鼠胚胎干细胞(mESCs)。随着时间的推移，这些“胃泌素”模拟了小鼠发育过程中的许多早期发育事件:对称破坏、极化基因表达、轴伸长和3个胚胎轴的形成。新利体育网页版胃泌素是高度易操作的，允许精确的实验操作，很难对胚胎进行。正是由于这些原因，我们认为胃泌素会在dart过程中替代小鼠。

在这个项目中，我们建议直接瞄准药物开发领域，在该领域，动物是dart的主要模型。首先，我们将制定标准的胃泌素方案，检测致畸药物的母体化合物及代谢物(如沙利度胺;THD &丙戊酸;VPA)影响胃泌素的发育。利用现有的报告基因mESC株系(例如BraGFP)和表达所有3种细菌层标记的工程新株系，我们将实时测量这些药物如何改变胃样蛋白模式、基因表达和形态。疣状,原位杂交(ISH)和ISH连锁反应将为静态时间点细胞命运和模式的变化提供补充和增强的评估。通过将胃泌素偶联到在体外我们将在精确的时间间隔内将胃泌素暴露于更生理的方式产生的一系列浓度的THD和VPA代谢物中，以确定在多大程度上和什么时间模式被破坏。以抗癫痫药物(如VPA、左乙拉西坦、唑尼沙胺)为重点，我们将评估综合治疗对胃泌素发育的影响，这种治疗方案可能会增加先天性异常的风险。

最后，我们将使用人类胚胎(hESC)和人类诱导多能(hiPSC)干细胞系建立一种生成胃泌素的方案，这将使我们能够评估更适用于人类发育的药物的效果，而不使用胚胎。使用荧光共聚焦和广角显微镜的组合，将量化感兴趣的药物(从第一个目标识别)在实时(使用现有的三重细菌层报告hESCs)和在固定、静态的时间点对胃粘膜模式的影响。该项目将使我们能够在一个适合人类发展的模型中深入了解药物诱导的发育毒性，为我们提供了一个有可能大大减少在dart中使用动物的实验平台。