亲和蛋白直接替代二抗

我们为什么要资助这个项目?

该奖项旨在用可以产生的亲和蛋白取代山羊、绵羊和驴等哺乳动物产生的第二抗体在体外．

抗体被广泛应用，包括在临床前研究中，以识别特定靶点和纯化蛋白质。可以产生初级抗体在体外然而，第二抗体通常在动物中产生，主要是山羊、绵羊或驴。动物被免疫并放血，这样产生的抗体就可以被收集。这可能会在动物的一生中重复很多次。通过这种方式产生的抗体可以识别感兴趣的抗原上的多个目标，增加信号并减少试验中的背景噪声。Christian Tiede博士和他的同事们此前已经开发出Affimer蛋白，这种蛋白与目标分子结合具有类似的特异性和动物源性抗体的亲和力。这些工程蛋白可以被生产出来在体外在细菌细胞中进行重组，并被用于靶向500多种不同的蛋白质。

该学生将把亲和蛋白分离到小鼠和兔抗体的恒定区域，以产生能够发挥类似于二抗作用的亲和蛋白。然后将它们与辣根过氧化物酶或荧光团融合，用elisa、western blotting和免疫组化等抗体使用普遍的技术进行检测。学生还将发展蛋白质生产和噬菌体展示的技能。

抗体是科学、医学研究和诊断中不可或缺的工具。抗体与目标分子结合的敏感检测通常需要检测信号的放大。这通常涉及一级和二级抗体的两阶段检测过程。一抗直接与目标抗原结合，而二抗通常与酶结合用于检测，与一抗的恒定区域结合。一抗通常是单克隆的，在CHO细胞培养中重组产生，而二抗通常是多克隆的，因此只在哺乳动物中产生，主要是山羊、绵羊或驴。除了与动物使用相关的伦理问题外，交叉反应问题和批与批之间的差异阻碍了良好生产规范所需的标准化生产。迄今为止，只采取了有限的尝试来减少动物中二抗体的产生，还没有商业化的替代方法。

我们的目标是用在体外选择在重组中产生的亲和蛋白大肠杆菌．亲和性蛋白是已建立的多功能结合蛋白试剂，可在许多应用中取代抗体。亲和性蛋白具有发育时间短(2-4周)、亲和力高、稳定性好、表达率高等特点大肠杆菌．此外，它们可以很容易地通过生物素、荧光团的位点特异性标记或与酶的基因融合进行操作，并可以作为单或双特异性亲和分子结构生成。迄今为止，通过噬菌体展示，我们已经成功地筛选出了500多种蛋白质、肽或化学物质的亲和蛋白。它们的效用已经在eLife, Blood, PNAS, EMBO, Science signaling, Molecular Cell和Nature Structural & Molecular Biology等期刊的高影响力出版物中得到证实。

我们将利用噬菌体展示技术分离小鼠和兔抗体的恒定区域的亲和蛋白，并对人类片段可结晶(Fc)进行反选择。所选的结合物将被测试与固定区域上不同的表位结合，目的是选择尽可能多的独特的表位结合物。获胜的候选抗体将被融合到人类Fc区域，使其成为二价抗体，因此类似于二抗。亲和性Fc融合蛋白将产生，随后用辣根过氧化物酶或荧光团标记。它们检测一抗的能力将通过酶联免疫吸附试验、western blotting和免疫组化方法与市售二抗的直接比较进行测试。

我们的方法寻求替代和减少用于生产二抗的动物。仅在英国，我们所提议的二级试剂的成功实施每年就可以拯救超过760名哺乳动物。亲和蛋白提供了抗体的真正替代品。我们之前的工作表明亲和蛋白可以在许多应用中直接取代初级抗体。这一提议是我们迄今为止所做努力的延续，也是第一次尝试使用Affimer技术替代二抗。我们的长期目标是执行指令2010/63/EU，该指令要求在存在非动物替代品的情况下，不得将动物用于科学目的。