斑马鱼感染过程中巨噬细胞表型的调节

巨噬细胞是重要的白细胞，吞噬入侵的细菌，并通过上调抗菌杀死机制(称为促炎巨噬细胞极化)对感染做出反应。在最初的反应后，巨噬细胞群改变行为为更多的抗炎表型，以参与受损组织的愈合，以使组织恢复正常(称为抗炎巨噬细胞极化)。尽管人们对体外巨噬细胞表型有了深入的了解，但巨噬细胞在感染组织中表现出的不同行为还不太清楚，这为开发针对抗微生物药物耐药性日益严重的感染(例如结核分枝杆菌感染)的新药提供了机会。

在这里，我们提议开发一个斑马鱼抗炎巨噬细胞的幼虫模型，将允许在体内检测结核感染期间巨噬细胞的极化。这将取代侵袭性感染的哺乳动物模型，并减少使用的动物总数。

巨噬细胞极化的一个标志是它们的抗微生物一氧化氮(NO)输出，促炎巨噬细胞上调诱导型一氧化氮合酶(iNOS)导致NO水平升高，抗炎巨噬细胞上调精氨酸酶导致NO水平降低。我们已经制作了arginase2:GFP转基因系，如果开发和验证，将是第一个斑马鱼抗炎巨噬细胞转基因模型。我们已经观察到在肉芽肿中表达GFP的巨噬细胞，这是结核病感染的标志结构。我们已经证明，在斑马鱼海洋分枝杆菌(Mm)结核病模型中，对缺氧诱导因子-1 α (hif -1 α，细胞缺氧反应的主要转录调控因子)和Tribbles信号通路的操纵，可以改善感染结果，并对巨噬细胞有深远影响。

我们假设在分枝杆菌感染过程中巨噬细胞的促炎和抗炎信号是不正常的，可以在体内调节以改善感染的结果。

我们的具体目标是:

1.测定体内巨噬细胞对Mm感染的抗炎反应。

我们将把arg2:GFP交叉到现有的巨噬细胞:红色标记线中，并使用共聚焦和旋转盘显微镜来确定从感染早期，感染后1天(dpi)到感染后4dpi肉芽肿阶段，哪些细胞上调arg2:GFP。我们将量化arg2:GFP阳性巨噬细胞的行为，包括迁移、吞噬和细菌杀伤。将对arg2:GFP阳性巨噬细胞进行FACS纯化和RNAseq/qPCR鉴定arg2:GFP+ve巨噬细胞的谱，并将其与小鼠/人类数据集进行比较。

2.描述感染过程中促炎/抗炎巨噬细胞极化的动态。

我们将把arg2:GFP转基因系与促炎标志物转基因系交叉，并使用时间延迟显微镜和表达研究来确定巨噬细胞标志物表达的动态，确定arg2:GFP巨噬细胞是否起源于促炎人群，或者其他巨噬细胞是否迁移到感染部位并直接分化为表达arg2:GFP的表型。

3.治疗性操纵巨噬细胞促炎/抗炎极化以改善感染结局。

我们将操纵双转基因中的HIF和Tribbles信号通路，这是促炎/抗炎巨噬细胞表型的已知调节剂。读数将包括促炎/抗炎报告细胞系和细菌负担，以评估对感染结局的影响。与此同时，将通过基于CRISPR-Cas9的小基因筛选和siRNA敲除在不朽的小鼠骨髓来源巨噬细胞系中研究aim 1中RNAseq的潜在靶点。