降低CRISPR/Cas9诱变的动物成本

项目背景

基因的功能及其在生物过程中的作用可以通过在相关生物系统中敲除基因的两个副本来研究。如果基因功能在免疫系统等复杂的生物过程中起作用，或影响行为，那么通常需要动物模型来充分探索基因功能。基因组编辑的最新进展允许通过微注射CRISPR/Cas9小鼠受精卵来生成转基因(GM)小鼠模型。然而，在微注射后，产生的创始人小鼠经常镶嵌在小鼠体内，存在许多不同的突变。这是因为Cas9酶在单细胞受精卵胚胎发育阶段后经常保持活性，并继续切割DNA，导致每个子细胞中的不同突变。这使得有必要从创始人产生后代，首先获得所需的突变，其次，培育突变存在于整个生物体中的小鼠。在实施这种新的基因组编辑技术时，这种育种的必要性和程度确实增加了使用的小鼠数量。此外，当将特定突变引入目标基因时，Cas9酶的活性也会产生问题，因为在目标基因的另一个副本中也有可能出现第二个突变。这可能导致创始动物出现更严重的表型，并对福利产生相关影响。

我们为什么资助它

该项目旨在通过开发CRISPR/Cas9系统的新方法，减少开发具有所需突变的感兴趣转基因模型所需的小鼠数量。

减少CRISPR/Cas9生成的转基因小鼠的嵌合性可以潜在地减少创建创始人代之后的育种程序的数量。目前，在转基因小鼠中产生一个特定的突变需要大约五个创始人。这五种创始人通常都是镶嵌的，需要与野生型小鼠繁殖，才能产生具有所需突变的后代。每个创始人生产的一窝平均有6只后代，然后对它们进行基因分型，因此每个模型总共培育30只小鼠。戴维斯博士估计，通过消除镶嵌现象，只需要产生两个创始者来提供感兴趣的突变，将所需小鼠数量减少到12只，减少了60%。在对一些转基因设施进行调查后，戴维斯博士估计，CRISPR/Cas9每年生成6800只小鼠模型。这意味着全球每年有可能减少12.24万只老鼠。

研究方法

为了消除嵌合现象，本项目旨在将Cas9的活性限制在单细胞胚胎阶段。Cas9酶将被融合到一个调控域以限制其活性，两种不同类型的调控域将被研究。第一个结构域是细胞周期调节结构域，它导致Cas9在细胞分裂过程中降解，从而将活性限制在单细胞胚胎中。第二种方法使用不稳定域，当配体从培养基中去除时，导致Cas9降解。如果在适当的时间将该配体从胚胎培养基中去除，Cas9活性可能再次限制在单细胞胚胎中。还将研究Cas9的传递模式，以确定通过基因或蛋白质提供失稳的Cas9是否会影响在转基因小鼠中观察到的嵌合现象。

在目标等位基因中产生敲入突变可导致非目标等位基因中的碱基插入或删除。这可能会导致非靶向等位基因的缺失突变，当与靶向等位基因上的敲入突变结合时，会导致小鼠比预测的更严重的表型。调控域、Cas9传递方法和共注射野生型修复模板的影响都将被评估其对非靶向等位基因突变率的影响。