提取斑马鱼的皮肤DNA样本
简介
斑马鱼、棘鱼等小型硬骨鱼类是实验室中常用的实验模型。通常从这些动物身上采集DNA进行基因鉴定(基因分型)。目前提取DNA样本的标准程序是剪鳍，包括将鱼置于非终末麻醉状态下，然后用手术刀切除一部分尾鳍。虽然剪鳍可以可靠地生成高质量的DNA样本，用于PCR鉴定动物，但有证据表明，它会影响鱼类的健康和福利，导致疼痛、压力和行为的变化[1 - 7］．这反过来又会导致生理和行为数据的更大差异[8］．
修剪鱼鳍的另一种方法是皮肤拭子，用人造纤维头拭子或棉签从鱼的侧翼收集粘液，然后进行处理以提取DNA [9 - 11］．行为和生理证据表明，皮肤拭子对鱼类福利的影响较小[8、11]，为改善实验室鱼类的DNA取样程序提供了机会。在实用性方面，拭子法与剪鳍法相当，有一些潜在的优势(见下表)。
来自莱斯特大学和诺丁汉特伦特大学的威尔·诺顿博士及其同事已经证明，皮肤拭子可以成功地从斑马鱼和刺鱼身上采集DNA。作为一种改良方法，人们对皮肤擦洗的兴趣越来越大，研究人员和技术人员对这种技术是否适用于他们的工作，以及如何正确地进行皮肤擦洗有越来越多的疑问。该资源包含详细的信息，以帮助研究小组了解更多关于皮肤拭子作为一种福利改良，以及如何在他们的实验室建立皮肤拭子的协议。
鳍剪和皮肤拭子比较表
传统方法:剪鳍 |
改良方法:皮肤拭子 |
|
|---|---|---|
动物的大小 |
幼虫> 3.5 mm |
目前已验证幼鱼≥20毫米 |
样本收集时间 |
~60秒麻醉夹鳍(不包括恢复时间) |
约30秒，抑制，拭子和回到储存罐 |
镇痛 |
需要前后程序 |
不是必需的 |
麻醉 |
需要手术麻醉，常用MS-222 (tricaine) |
不是必需的 |
提取方法 |
HotShot方法，异丙醇提取和商业试剂盒 |
HotShot法或异丙醇萃取法;商业套件的效果较差 |
数量 |
||
成本 |
每个样品的成本相当于皮肤拭子(例如使用HotShot方法)。可重复使用的手术刀或剪刀可以用于多条鱼。 |
每个样品的成本与剪鳍相当(例如使用HotShot方法)。消耗性棉签比一次性手术刀便宜得多;不需要购买麻醉剂。 |
技术水平 |
需要培训和个人授权;必须限制鱼类使用化学药剂(麻醉) |
需要培训;对鱼的身体限制是必要的 |
伦理批准 |
需要英国内政部批准的许可程序 |
需要当地的伦理批准，例如来自awerbiacuc或同等机构 |
常见问题
我们采访了莱斯特大学动物生物学副教授威尔·诺顿博士(WN)和埃克塞特大学水生设施经理和NACWO格雷戈里·保罗博士(GP)，回答了您的问题，并解决了人们对皮肤拭子技术的常见担忧。
WN:我们的完整协议可以在线阅读．你可以得到所有的信息，你需要设置你的设备和拭子的实际步骤在这篇发表的方法文章。首先，我们建议按照公布的协议，练习用手网控制和释放鱼。第一次拿鱼可能有点棘手，但你做得越多就越容易。与所有的新技术一样，它需要一些实践来完善你的方法，但最初的时间投资是值得的，它可以将DNA采样对鱼类健康和福利的影响最小化。
医生:我建议从大的、短鳍的成年鱼开始，因为这将使处理鱼更容易一点，并将让你在进行DNA采集技术方面获得信心。
在进行手术时，确保你准备好了所有的设备，并确保你只带了可以在不损害动物福利的情况下舒服地进行手术的动物数量。例如，鱼不应该在非系统的容器中保存足够长的时间，因为水温会发生变化。
我的同事Karin Finger-Baier(马克斯-普朗克研究所)有以下建议:
“我的建议是，在使用从鳍夹中提取的DNA时，从产生强条带的线条开始。在建立皮肤拭子检测时，我还建议平行地对同一条鱼(不一定是同一条鱼)进行鳍夹和拭子检测，并比较结果(例如PCR、凝胶电泳、测序等)。当这些结果表明某条线的性能较弱时，我们的解决方案是使用两倍于我们通常使用的体积来建立PCR，这很有效。”
WN:我们使用手网(如Marina Fine Soft Mesh鱼网或类似产品)和切有槽的湿海绵(如Vitrex 102904方形海绵或类似产品)组合来抑制鱼。用鱼网覆盖鱼的头部和尾部，用拇指和食指按住鱼不动(见下图的例子)。鱼的身体被放置在海绵的凹槽中，这有助于保持它不动。有些人喜欢用平整的、湿润的、没有凹槽的海绵[9，或一次性湿纱布而不是海绵[10——你觉得最快捷、最实用的技术取决于你的个人喜好。
这样做的目的是尽可能快地取下你的样本并把鱼放回水中，所以在你把鱼捞出水面之前，确保一切都准备好了。如果你不习惯约束小鱼，我们建议你在试着擦洗之前练习安全有效的约束。你会很快获得信心，并找到适合你的方法。
医生:我听到的一个普遍担忧是，在没有镇静的情况下处理体型较小的鱼是具有挑战性的。如果这是你在一开始遇到的困难，最好先从稍微大一点的动物开始，然后再处理较小的鱼，一旦你对技术有信心了。
为了使整个过程顺利进行并保持鱼的平静，请使用安静的空间，避免嘈杂的房间、振动和高脚步声的区域。鱼会发现暴露在明亮的灯光下会感到压力，这会影响它们的跳跃程度。在你开始一项工作之前，盖上容器通常是减轻压力的有效方法。
如果你已经练习过这项技术，并采取了合理的步骤来保持鱼的平静，处理未麻醉的鱼应该会变得更容易。如果你继续与手动控制斗争，例如，当处理一个特别活跃的线，你可能会得出结论，没有镇静拭子不是你的最佳选择。对新技术的可能性持开放的态度是很重要的，但对什么将适合你自己的情况持务实的态度也是必不可少的。作为研究人员，我们有责任尽可能完善我们的方法;试验皮肤拭子将让您看到它是否适合您的个人情况。
WN:当擦拭鱼时，几乎不需要压力，以防止任何可能的不适或对动物的伤害。轻轻抚摸鱼的侧面，从鳃下开始，向尾部移动，就可以收集粘液(这个方向对有鳞片的鱼很重要，比如斑马鱼)。
医生:只需要轻微的压力，拭子应该沿着鱼的侧翼一次干净的移动到尾部。避免擦拭鳃盖/鳃区。我建议从鳃板后面一个宽度的拭子开始，甚至从身体的一半开始就足够了，如果这意味着避免不必要的压力，不得不重新定位鱼。在到达鱼尾时，提起鱼身上的棉签，重复这一步骤以获取足够的材料。对于长鳍鱼，在收集DNA样本之前，你可能需要轻轻地清除胸鳍。这可以通过使用相同的棉签来完成。
WN:我们使用皮肤拭子技术可靠地收集了≥20毫米的鱼的DNA [9］．我们正在探索≥10毫米的斑马鱼是否可行，但这需要仔细研究，因此我们目前不推荐对小于20毫米的鱼采用这种技术。
斑马鱼胚胎期基因分型的一种侵入性较低的选择是斑马鱼胚胎基因分型(ZEG)技术冠军， NC3Rs的技术人员通讯。
WN:我们成功地使用了市面上可以买到的人造棉签和在药店或超市买到的简单棉签。虽然这些都是消耗品，但它们很容易以很低的成本获得。拭子不需要单独包装，但应在使用前进行高压灭菌和干燥。我们希望试验使用更小尖端的棉签，可用于96孔板。
WN:当从鱼的侧翼收集粘液时，如果拭子沾湿了一点也没关系。这不会影响后续的DNA提取。
WN:在扩增基因以识别鱼类时，擦皮和剪鳍似乎同样有用。用皮肤拭子采集的DNA会导致提取的DNA浓度比剪鳍要低．然而，我们的研究表明这两种技术的DNA纯度是相似的［9］．
在我们的实验室中，我们经常使用皮肤拭子来通过PCR鉴定斑马鱼品系。我们发现，一旦我们熟悉了皮肤拭子取样技术，我们就很少有样本不能通过PCR或序列扩增。当使用鳍夹DNA作为模板进行PCR反应测序时，我们看到了类似的成功水平，但可能需要一些实践来优化您的设施中的皮肤拭子技术。
在同行评议的文献中，皮肤拭子的DNA已被用于通过PCR成功识别鱼类[9-14］．研究的斑马鱼品系为AB野生型、casper、Tg(vmat2:GFP)、Tg(hb9:GFP)、Tg(glyt2:GFP) [9];nhgri1, kca33Tg, kca66Tg [10］．性别标记也被用来区分雄性和雌性刺鱼[9],青鳉[13和野蟑螂[14使用皮肤拭子采集的DNA。
我们还没有尝试使用从皮肤拭子样本中提取的DNA进行拉德- tag测序或全基因组测序，因此我们目前不能对拭子用于这些目的的适用性发表评论。这是我们未来想要研究的东西。
医生:你可能会发现拭子取样并不适用于所有的目的，但如果它在90%的情况下都有效，那就已经是一种进步了，因为它减少了世界范围内接受这种侵入性手术的动物的数量。
WN:皮肤拭子收集被鱼脱落并困在鱼黏液层的皮肤细胞。
WN:不，皮肤拭子已成功应用于体长≥30毫米的鱼类的DNA取样，这是一种微创的方法[12，13),两栖动物(15和哺乳动物[16］．我们的研究已经验证了小体型(≥20毫米)实验室鱼类的皮肤拭子DNA采样。通常情况下，从实验室鱼类中提取DNA样本的标准方法是剪鱼鳍，而提取鱼鳍则提供了改进的机会。
医生:我在埃克塞特大学的同事安克·兰格博士已经成功地用皮肤拭子测定了蟑螂(幼年和成年)和刺鱼的基因性别。在同一个研究小组中，他们还成功地使用皮肤拭子对罗非鱼皮肤微生物组进行元条形码编码[17］．
WN:在我们的手中，我们发现使用标准分子生物学方法(苯酚:氯仿提取)提取DNA比从斑马鱼和刺鱼身上提取皮肤拭子粘液样本的商业试剂盒效果更好[9］．其他研究人员将皮肤拭子协议与HotShot DNA提取结合起来[10］．
WN:我们的研究着眼于压力下的行为和生理指标，发现总的来说，拭子对鱼的影响不如剪鳍收集DNA深刻[8］．例如，我们发现在割鳍过程中去除组织会导致皮质醇的释放明显增加而当鱼被擦拭时，水中的皮质醇水平与未受干扰的对照组没有显著差异。
割鳍对动物福利的负面影响部分来自于必须对动物进行麻醉。例如，MS222(三卡因)治疗改变了眼睛跳动率，这是斑马鱼和刺鱼的通气测量指标[8]及常用的麻醉剂已被证明对斑马鱼有排斥作用[17、18］．
擦洗是一种侵入性较低的过程，不需要对鱼进行麻醉。被网住并带到空气中擦洗的过程对鱼类来说是有压力的，但通过减少与取样程序有关的压力(即擦洗而不是剪鳍)，可以减少动物的累积痛苦。
WN:任何涉及到捕鱼，把它带到空气和处理它的程序都会给动物造成一些痛苦。重要的是，我们一直在寻找改进程序的方法，以尽量减少鱼类遭受的整体痛苦。从我们的研究结果来看，我们相信用皮肤擦拭代替剪鳍将减少实验室鱼类所经历的累积痛苦。
我们正在研究进一步细化擦拭的方法，首先要了解更多的粘液被移除的量和粘液层恢复的速度。我们还没有观察到任何继发性感染，也没有观察到对我们拭取的鱼造成损伤的证据，但粘液对鱼抵御细菌和病原体很重要，所以我们想了解更多这方面的知识。我们还与其他公司合作，探索进一步完善擦洗程序的方法，例如，用止痛剂量的利多卡因(2mg/l)预处理鱼。
WN:在这个出版协议我们使用了镇痛剂量的利多卡因(2mg/l)，但没有将鱼置于麻醉之下。利多卡因可以有效减少斑马鱼的疼痛，并用于一些鳍剪断方案，因此我们有动力探索用止痛剂进行预处理，作为进一步改进擦拭程序的潜在方法。我们没有证据表明鱼在擦拭过程中会有任何不适，但我们希望采取一种谨慎的方法，在我们进一步调查时提供止痛剂。我们目前正在研究这一领域的数据，并将在未来进一步评论皮肤拭子止痛的提供。
需要注意的是，如果使用正确的方法，擦洗本身并没有获得许可，但使用止痛剂量的利多卡因对鱼进行治疗需要内政部的批准。
WN:我们的研究表明，从拭子鱼身上收集到的数据——测量皮质醇释放、焦虑行为指标和基因表达——比鳍剪鱼的变化更少。这创造了额外的3Rs效益，因为需要更少的动物来获得足够的统计能力。从实用的角度来看，皮肤拭子本身并不是一个有许可证的程序(在英国)，我们的实验室人员更喜欢使用拭子而不是手术刀，因为对用户的伤害风险更小。
医生:不使用麻醉对环境也有好处;当麻醉剂被丢弃在水槽中，它们有可能影响生态系统。
WN:我们认识到，有经验的人员能够高效地进行割鳍工作，而相关设施也致力于将对动物的伤害降至最低，但我们只能就数据所显示的情况发表意见。有强有力的证据表明，常用的麻醉剂对鱼是有害的[在18到22岁而且割鳍过程本身会造成压力和疼痛[1 - 7］．皮肤拭子仍然是一个需要护理的过程;然而，我们的数据显示，它对鱼类福利的影响有所减少[8]，我们相信这为完善实验室鱼类的DNA收集提供了机会。
我们的最终目标是改善实验室鱼类的福利，我们邀请其他人分享他们所拥有的任何数据，以突出改进的机会，或直接与我(whjn1@le.ac.uk)或使用nc3r (tech3rs@nc3rs.org.uk）.
WN:如果您需要培训项目的帮助，我们很乐意提供支持(whjn1@le.ac.uk）.同时，在安全性和厌恶性方面，使用最完善的麻醉方案[在18到22岁]，确保手术前后使用镇痛来控制疼痛[2、20、21]，让鱼类恢复与其他鱼类的视觉接触[23(例如，把鱼缸推到一起，让鱼能看到彼此;或者把鱼缸隔开，让鱼在视觉和嗅觉上都有接触。)
医生:同时也要考虑为了你的目的需要从鱼身上去除多少组织，不要取比需要更多的鱼鳍。我曾与斑马鱼用户交谈过，他们回顾了自己的鳍剪断协议，发现只有非常小的一块组织(例如1-2mm2相当于一个尾叶的尖端)，以完成>10 PCR操作。尾鳍剪回尾部裂片的剪刀被认为是完全没有必要的。取下的组织片越小，鱼恢复得就越快，也就能更快地回到自己的鱼缸里。
协议
看到详细的皮肤取样规程，以了解如何运用拭子技术收集小型鱼类(例如斑马鱼)的DNA。该方案包括所需设备的信息，如何设置，试剂的制备和DNA提取。
视频
实验室鱼类皮肤拭子的研究论文
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确认
我们非常感谢威尔·诺顿博士(莱斯特大学)、Ceinwin Tilley博士(莱斯特大学)、Gregory paul博士(埃克塞特大学)、Chrissy Hammond博士(布里斯托尔大学)、Mollie Millington(弗朗西斯·克里克研究所)、Stewart Owen博士(阿斯利康)、Karin Finger-Baier(马克思·普朗克研究所)和Anke Lange博士(埃克塞特大学)的贡献。
参考文献
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